Ανασκόπηση των τελευταίων εξελίξεων στην καλλιέργεια βλαστοκυττάρων, κυτταρική μηχανική και βιοτεχνολογία που μπορούν να βοηθήσουν ουσιαστικά στη θεραπεία των ασθενειών του κερατοειδούς χιτώνα.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1ο: Η ΘΕΩΡΙΑ
Είναι αναμφισβήτητο ότι διανύουμε μια περίοδο τεράστιων και αξιοθαύμαστων αλλαγών στην αντιμετώπιση των ασθενειών του κερατοειδούς χιτώνα και της οφθαλμικής επιφάνειας, καθότι αλλάζει τελείως το τοπίο στις μεταμοσχεύσεις κερατοειδούς, όπου πια δε θα συζητούμε για μεταμοσχεύσεις ετερόλογου ή αυτόλογου ιστού με την παραδοσιακή έννοια του όρου αλλά για θεραπείες σε κυταρικό/ βιοσυνθετικό επίπεδο.
Η ιστορία των μεταμοσχεύσεων μέχρι τώρα
Ο παγκόσμιος επιστημονικός κανόνας αυτή τη στιγμή στις μεταμοσχεύσεις κερατοειδούς είναι ότι οδηγούμαστε σταδιακά σε όλο και πιο στοχευμένες, μερικού πάχους τεχνικές στις οποίες αντικαθίσταται μόνο το παθολογικό μέρος του κερατοειδούς χιτώνα, κάνοντας τα χειρουργεία μας όλο και πιο ασφαλή και λιγότερο επεμβατικά.1
Η μετάβαση από τις διαμπερείς κερατοπλαστικές στις από τη μια μεριά, πρόσθιες και εν το βάθει τμηματικές κερατοπλαστικές (ALTK, DALK), και από την άλλη στις όλο και λεπτότερες μεταμοσχεύσεις ενδοθηλίου και Δεσκεμετείου μεμβράνης (DSEK, utDSAEK, DMEK), έχουν δημιουργήσει ένα καινούργιο επιστημονικό κανόνα αυξημένης επιβιωσιμότητας των μοσχευμάτων, λιγότερων επιπλοκών, καλύτερων χειρουργικών αποτελεσμάτων και υψηλότερων επιπέδων όρασης των ασθενών.
Παρόλη τη σημαντική αυτή πρόοδο όμως, οι ασθενείς μας συνεχίζουν να αναβάλουν όσο μπορούν ένα χειρουργείο μπροστά στην ιδέα της «μεταμόσχευσης», λόγω του φόβου επιπλοκών και της πολυπλοκότητας αυτού που είναι ακόμη σημαντική. Έτσι συνήθως αποφασίζουν να προχωρήσουν σε μια επέμβαση όταν η όραση τους έχει υποχωρήσει κάτω από το μισό και ίσως ακόμη παρακάτω, καταλήγοντας να περνούν σημαντικό μέρος της ζωής τους με χαμηλότερα επίπεδα όρασης. Και αυτό χωρίς να λαμβάνουμε υπόψη τα εκατομμύρια των ασθενών που λόγω κοινωνικοοικονομικών συνθηκών που επιδεινώθηκαν λόγω της πανδημίας, δεν έχουν πρόσβαση στην επέμβαση συνολικά2.
Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας εκτιμά ότι 10 εκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως χρειάζονται χειρουργική επέμβαση για την αποκατάσταση της όρασής τους λόγω θόλωσης του κερατοειδούς ως αποτέλεσμα του τραχώματος, ενώ άλλα 4,9 εκατομμύρια υποφέρουν από ολική τύφλωση λόγω ουλών του κερατοειδούς.
Αυτή η μη ικανοποιητική αυξανόμενη ανάγκη για δότες κερατοειδούς έχει οδηγήσει ήδη από της αρχές του αιώνα μας σε όλο και εντεινόμενη προσπάθεια για την ανάπτυξη τεχνητών υποκατάστατων κερατοειδούς, τα οποία πρέπει να πληρούν συγκεκριμένα κριτήρια εάν πρόκειται να μιμηθούν λειτουργικά τον φυσικό κερατοειδή.
Ήδη από το 2011 οι Τράπεζες Οφθαλμών παγκοσμίως έχουν βελτιώσει τις πρακτικές τους σε τέτοιο βαθμό ώστε να έχουν φτάσει κοντά στη μέγιστη δυνατότητα συλλογής, επεξεργασίας και διάθεσης ιστών (maximum capacity) προερχομένων από νεκρό ανθρώπινο δότη. Αυτό τις οδήγησε στο να στραφούν, με τις κατάλληλες συνεργασίες με ερευνητικούς οργανισμούς και πανεπιστήμια, όπως και εταιρείες ιατρικού ενδιαφέροντος, στη δημιουργία κυτταρικών μοσχευμάτων εγκαταλείποντας τη επεξεργασία ολόκληρων ιστών προς μεταμόσχευση από νεκρούς δότες.
Οι συγκρουόμενοι επιστημονικοί κανόνες και το προβληματικό παράδοξο
Το πρώτο παράδειγμα είναι ότι ο επιστημονικός κανόνας (paradigm) των μεταμοσχεύσεων κερατοειδούς μετατοπίζεται προς την προτίμηση για τις τμηματικές κερατοπλαστικές, πράγμα που σημαίνει ότι οι μεταμοσχευτικοί χειρουργοί υιοθετούν σταδιακά νεότερες μορφές χειρουργικής μεταμόσχευσης τμημάτων του κερατοειδούς, στις οποίες αντί να αντικαθιστούν ολόκληρο τον κερατοειδή, αντικαθιστούν επιλεκτικά μόνο τα παθολογικά στρώματα του κερατοειδούς, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα πιο γρήγορα και προβλέψιμα οπτικά αποτελέσματα εξαλείφοντας την ίδια στιγμή τον κίνδυνο απόρριψης.
Αυτές οι ταχείες εξελίξεις στις τεχνικές τους έχουν οδηγήσει στη χρήση προετοιμασμένων ιστών, μικροκερατόμων, χειρουργικής επέμβασης με χρήση Femtosecond laser, κ.λπ, και ως συνέπεια στην ουσιαστική αύξηση του κόστους αυτών των χειρουργικών επεμβάσεων.
Αυτό οδήγησε στις τρέχουσες προκλήσεις πρόσβασης των ασθενών σε αυτές τις πολύ ακριβές επεμβάσεις (οικονομικός κανόνας) που εξαναγκάζει τους χειρουργούς να κάνουν λιγότερες μεταμοσχεύσεις κερατοειδούς από ότι στο παρελθόν. Η κύρια πρόκληση έχει να κάνει με την αποζημίωση για τον κερατοειδή ιστό αλλά και τη χρήση αυτής της τεχνολογίας: Εάν χάνουμε συνεχώς οικονομικούς πόρους για την απόκτηση των μοσχευμάτων κερατοειδούς που χρειαζόμαστε, τότε στο τέλος πραγματικά περιορίζεται ο συνολικός αριθμός των επεμβάσεων.
Αυτή η σύγκρουση των κανόνων οδηγεί στο μεγάλο παράδοξο στη σύγχρονη χειρουργική μεταμόσχευσης κερατοειδούς, στην οποία αφενός οι χειρουργικές διαδικασίες μας είναι πιο Hi-Tech και πιο προηγμένες από ποτέ, αλλά από την άλλη πλευρά είναι τεχνικά πιο δύσκολες και πιο ακριβές από ποτέ, με αποτέλεσμα τη διενέργεια ενός συγκριτικά μικρότερου συνολικού αριθμού μεταμοσχεύσεων από ότι χρειάζεται παγκοσμίως.
Το προβληματικό παράδοξο: «Είμαστε παγιδευμένοι σε πολύ ακριβές εξειδικευμένες επεμβάσεις, χρησιμοποιώντας πολύ ακριβό εξειδικευμένο εξοπλισμό, από πολύ εξειδικευμένους χειρουργούς, που τελικά προορίζονται μόνο για εξειδικευμένους ασθενείς ή συστήματα υγείας που μπορούν να ανταπεξέλθουν οικονομικά, αφήνοντας τους πολλούς χωρίς θεραπεία και με απώλεια όρασης»
Η απάντηση σε αυτό το παράδοξο και η στρατηγική πρόκληση ταυτόχρονα είναι οι νέες λύσεις και θεραπείες μεταμόσχευσης οφθαλμικών κυττάρων που αρχίζουν να εφαρμόζονται παγκοσμίως.
Η στρατηγική πρόκληση
Οι νέες θεραπείες κυτταρικής καλλιέργειας για ασθενείς που έχουν υποστεί απώλεια όρασης από ασθένειες του κερατοειδούς προσφέρουν μεγάλες υποσχέσεις για όλους τους ασθενείς, μεταμορφώνοντας το οικοσύστημα των θεραπειών του κερατοειδούς.
Ένα εξαιρετικό παράδειγμα μιας πολύ υποσχόμενης καινοτομίας σε αυτόν τον τομέα είναι η ενέσιμη θεραπεία ενδοθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς που θα αναλύσουμε πιο κάτω: Μια κυτταρική θεραπεία στην οποία καλλιεργούμε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς και στη συνέχεια εγχέουμε αυτά τα κύτταρα στον πρόσθιο θάλαμο του ματιού. Με αυτόν τον τρόπο από μια μικρή ποσότητα καλλιεργημένων ανθρώπινων κερατοειδικών ενδοθηλιακών κυττάρων μπορούν να πραγματοποιηθούν περίπου 200-300 μεταμοσχεύσεις κυττάρων, βοηθώντας εκατοντάδες ασθενείς με μια καλλιέργεια.
Η Λύση: «Από ένα καλλιεργημένο κύτταρο, εκατοντάδες μεταμοσχεύσεις κυττάρων»
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2o: Η ΠΡΑΞΗ
Ο κερατοειδής Χιτώνας
Ως προστατευτικό, εξωτερικό στρώμα του ανθρώπινου ματιού το οποίο καλύπτει την ίριδα και την κόρη, ο κερατοειδής έχει σημαντικό ρόλο στη διαθλαστική δύναμη του οφθαλμού.
Είναι υπεύθυνος για τη μετάδοση και τη διάθλαση των προσπιπτόντων φωτεινών ακτίνων που με τη σειρά τους επικεντρώνονται στον αμφιβληστροειδή χιτώνα μέσω του κρυσταλλοειδούς φακού.
Ο κερατοειδής χιτώνας αποτελείται από τρία κυρίως μέρη:
- Το εξωτερικό επιθήλιο με τη βασική μεμβράνη
- το στρώμα ενδιάμεσα και
- την εσωτερική Δεσκεμέτειο μεμβράνη με το ενδοθήλιο Η τύφλωση λόγω θόλωσης του κερατοειδούς είναι ένα ευρέως διαδεδομένο πρόβλημα που συχνά προκαλείται από μολυσματικές κερατίτιδες, εγκαύματα, τραυματισμούς ή άλλες ασθένειες επηρεάζοντας από ένα έως και όλα τα μέρη του. Ωστόσο, μπορεί και αντιμετωπίζεται αρκετά επιτυχημένα μετά από την κατάλληλη μεταμόσχευση ιστού κερατοειδούς.
Οι σύγχρονες θεραπείες: Επιθήλιο
Οι πρώτες σύγχρονες θεραπείες που εφαρμόστηκαν παγκοσμίως αφορούσαν κυρίως την ανεπάρκεια του επιθηλίου κερατοειδούς, και προέχονταν κυρίως από το Νοσοκομείο Queen Victoria Hospital, UK. Εκεί εφαρμόστηκε για πρώτη φορά η τεχνική Ex Vivo Expanded Stem Cell Allograft (EVSCAL)3, καλλιέργειας, δηλαδή ετερόλογων επιθηλιακών βλαστοκυττάρων από το σκληροκερατοειδές όριο νεκρού δότη, με τη χρήση γ-ακτινοβολημένων τροφοδοτικών κυττάρων 3Τ3, για τη δημιουργία κυτταρικών επιθηλιακών μοσχευμάτων και τη πλήρη αποκατάσταση της οφθαλμικής επιφάνειας (Εικόνα 1). Το επιστημονικά εκπληκτικό δε είναι ότι μετά την πάροδο εννέα μηνών δεν μπορούσε να εντοπιστεί ετερόλογο DNA στο μεταμοσχευθέν επιθήλιο κάτι που σημαίνει ότι είχαμε επανενεργοποίηση των τοπικών ή μετανάστευση αυτόλογων βλαστοκυττάρων επιθηλίου από τον μυελό των οστών. Οι θεραπείες αυτές βεβαίως έχουν απλοποιηθεί περαιτέρω με την υιοθέτηση νεότερων και απλότερων τεχνικών, όπως η Cultured Limbal epithelial transplantation (CLET) και η Simple Limbal Epithelial Transplantation (SLET)4.
Οι βιοσυνθετικοί κερατοειδείς χιτώνες: Στρώμα
Στο στρώμα του κερατοειδούς χιτώνα είναι γνωστό ότι υπάρχει ένας μικρός αλλά σημαντικός αριθμός δενδριτικών κερατοκυττάρων, τα οποία βρίσκονται σε μια κατάσταση μεταβολικής αναστολής/παύσης. Η προέλευση τους είναι εξελικτικά κοινή με τα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς κατά τη διάρκεια της κυήσεως (σημαντικό στοιχείο για τις κυτταρικές θεραπείες που θα συζητήσουμε πιο κάτω), δηλαδή από την κρανιακή νευρική ακρολοφία. (Εικόνα 2) Η κύρια λειτουργία των κερατοκυττάρων αυτών είναι η παραγωγή συστατικών του συνδετικού ιστού (πρωτεϊνογλυκάνες, θειϊκές κερατάνες, κ.λπ.) για τη βασική συντήρηση του στρωματικού ιστού5.
Μέχρι σήμερα έχουν δοκιμαστεί πολλές διαφορετικές μέθοδοι καλλιέργειας των στρωματικών κερατοκυττάρων ως μια εναλλακτική συντηρητικής μη χειρουργικής θεραπείας τραυματισμών, θόλωσης του στρώματος του κερατοειδή ή/και επαύξησης του πάχους του σε παθολογικές λεπτύνσεις, οι κυριότεροι των οποίων είναι:
- Ενδοστρωματική ένθεση στοιβάδων καλλιεργημένων λεπτών φακίδων στρωματικού συνδετικού ιστού εμπλουτισμένα με στρωματικά κερατοκύτταρα.
- En block τοποθέτηση τμήματος βιοσυνθετικού στρωματικού συνδετικού ιστού (καλλιεργημένου ex vivo ή τρισδιάστατα εκτυπωμένου) εμπλουτισμένου με στρωματικά κερατοκύτταρα-θα παρουσιαστεί παρακάτω-.
Τα κύρια προβλήματα αυτών των δυο τεχνικών είναι η στατιστικά σημαντική απώλεια έως 70% του αριθμού των καλλιεργημένων κερατοκυττάρων και η έλλειψη βίο-μηχανικής σταθερότητας του στρωματικού συνδετικού ιστού ακυρώνοντας πρακτικά τυχόν οφέλη.
- En block τοποθέτηση βιοσυνθετικού στρωματικού συνδετικού ιστού χωρίς την ύπαρξη καλλιεργημένων στρωματικών κερατοκυττάρων. Σε αυτή τη περίπτωση περιμένουμε τα κερατοκύτταρα του κερατοειδούς του λήπτη να μετοικήσουν στο καινούργιο στρώμα χωρίς όμως τα αναμενόμενα αποτελέσματα μέχρι τώρα.
- Η έγχυση εναιωρήματος κερατοκυττάρων ενδοστρωματικά.
Εικόνα 1: Η τεχνική Ex Vivo Expanded Stem Cell Allograft (EVSCAL)
Εικόνα 2: Η ανατομία του κερατοειδούς χιτώνα.
Βιομηχανική κερατικών στρωματικών κερατοκυττάρων (CSK)
Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω τα κερατικά στρωματικά κερατοκύτταρα (Corneal Stromal Keratocytes) στην ομοιόστασή τους είναι αδρανή, μη-μιτωτικά ενεργά κύτταρα, τα οποία βρίσκονται ενσωματωμένα στην εξωκυττάρια ύλη και στις ίνες κολλαγόνου (θειϊκή κερατάνη, λουμικάνη, κερατοκάνη, τρανσκετολάση, ALDH, CD34, κ.λπ.).
Σε οποιοδήποτε τραύμα ή άλλο stress του στρώματος, τα κερατοκύτταρα εγκαταλείπουν τον ομοιοστατικό τους φαινότυπο μεταλλασσόμενα σε ινοβλάστες, αλλάζοντας την ίδια στιγμή και τους δείκτες τους (Thy1, TNC, α5β1 integrin, Col3, etc). Οι ινοβλάστες είναι μιτωτικά ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα με πλήρη ανάκτηση της κινητικότητάς τους. Εάν δε υπάρξει και τραυματισμός ή απώλεια επιθηλίου, τότε οι ινοβλάστες μεταλλάσσονται περαιτέρω σε μυοϊνοβλάστες, μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται epithelial crosstalk και σηματοδοτείται με την έκκληση των δεκτών TGFβ, IL και TNFα, και που οδηγεί τελικά στη δημιουργία ουλής και απόπτωσης των κερατο- κυττάρων (Πίνακας 1).
Την ίδια αντίδραση δυστυχώς έχουν τα κερατοκύτταρα αν προσπαθήσουμε να τα καλλιεργήσουμε σε θρεπτικό ορό, μεταλλασσόμενα ξανά σε ινοβλάστες. Από προηγούμενες έρευνες όμως είχε φανεί ότι αν αυτή η καλλιέργεια γίνει σε στρώμα αμνιακής μεμβράνης ή χρησιμοποιώντας εκχύλισμα αμνιακής μεμβράνης τότε τα κύτταρα διατηρούσαν τον ομοιοστατικό τους φαινότυπο (δενδρίτες, σύνθεση κολλαγόνου, κ.λπ.), ενώ παρατηρήθηκε ακόμη και μερική αναστροφή του ουλοποιητικού φαινοτύπου των κερατοκυττάρων (μυοϊνοβλάστες) στον ομοιοστατικό φαινότυπο. Πάνω σε αυτές τις παρατηρήσεις βασίστηκε η στρατηγική για τη δημιουργία δύο ρυθμιστικών παραγόντων της καλλιέργειας κερατοκυττάρων (Πίνακας 2)6:
- Τον ρυθμιστικό παράγοντα ERI από τα αρχικά δηλαδή τρία συστατικά του: Human Amnion Stromal Extract (εκχύλισμα αμνιακής μεμβράνης), ROCK Inhibitor (που όπως είναι γνωστό προάγει τον πολλαπλασιασμό των συγγενών στα κερατοκύτταρα ενδοθηλιακών κυττάρων) και IGF1.
- Τον ρυθμιστικό παράγοντα SERI από τα αρχικά: low Serum supplemented ERI (δηλαδή ο παράγοντας ERI συνδυασμένος με χαμηλής περιεκτικότητας υγρό καλλιέργειας)
Όταν τα κερατικά στρωματικά κερατοκύτταρα εκτίθενται στον ρυθμιστικό παράγοντα SERI, μετατρέπονται σε ενεργοποιημένα κερατοκύτταρα μπαίνοντας στη Φάση S του κυτταρικού κύκλου, δηλαδή την αντιγραφή του DNA (διπλασιασμός χρωματίδας και ένωση των αδελφών χρωματίδων στο κεντρομερίδιο). Δεν μεταλλάσσονται όμως, κρατώντας τον φαινότυπό τους.
Δίνεται δηλαδή η δυνατότητα διατήρησης του φαινοτύπου των «ενεργοποιημένων κερατοκυττάρων» σε εργαστηριακές συνθήκες κατά τη διάρκεια καλλιέργειάς τους υπό τον παράγοντα SERI (χαμηλής συγκέντρωσης υγρό καλλιέργειας).
Αφού πολλαπλασιαστούν, τα κερατοκύτταρα μπορούν να επανέλθουν στην πρότερη κατάσταση ηρεμίας με τη χρήση του παράγοντα ERI. Έτσι επιτυγχάνεται αμελητέο ποσοστό μετάβασης σε ινοβλάστες και είναι εφικτή η ανάπτυξη θεραπειών που βασίζονται πάνω σε καλλιεργημένα κερατοκύτταρα.
Σε εφαρμογή των παραπάνω το 2018, o Hin-Fai Yam, et al7 σε έρευνα εγχύσεως καλλιεργημένων ανθρώπινων κερατοκυττάρων σε κερατοειδείς τρωκτικών με αρχόμενη θόλωση, τα εγχυμένα κερατοκύτταρα παρουσίασαν την κατάλληλη έκφραση δεικτών με αμελητέα χαρακτηριστικά φλεγμονής που σχετίζονται με ουλοποίηση, διατηρώντας έτσι τη διαύγεια και τη σταθερότητα του κερατοειδούς.
Η εξαρτώμενη από τον χρόνο απώλεια των κερατοκυττάρων ανακτήθηκε με επαναλαμβανόμενες εγχύσεις, επιτυγχάνοντας μια εκτεταμένη έκφραση ανθρώπινων πρωτεογλυκανών μέσα στο στρώμα κερατοειδούς των τρωκτικών. Στο αρχικό μοντέλο αρχόμενης θόλωσης του κερατοειδούς, η ενδοστρωματική έγχυση κερατοκυττάρων μείωσε την ανακλαστικότητα και το πάχος του στρώματος, ανέστρεψε τη νεοαγγείωση, με αποτέλεσμα την αποκατάσταση της διαύγειας του κερατοειδούς, ενώ οι μη εγχυμένοι κερατοειδείς ήταν παχύτεροι και έδειξαν εικόνα επιδείνωσης της θόλωσής τους.
Θα πρέπει επίσης να αναφερθεί η πολύ ενδιαφέρουσα εναλλακτική χρήσης των Μεσεγχυματικών Στελεχιαίων Κύτταρων (MSCs)8. Τα MSCs είναι ένας πληθυσμός πολλαπλασιαστικών και πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων που υπάρχουν σε διάφορους ιστούς κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Ανθρώπινα εμβρυϊκά MSC έχουν βρεθεί σε πολλούς διαφορετικούς εμβρυϊκούς ιστούς. Τα MSC είναι εύκολο να αναπτυχθούν σε εργαστηριακό περιβάλλον και έχουν τη δυνατότητα να διαφοροποιηθούν σε όλους τους τύπους κυττάρων κερατοειδούς. Μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικούς θεραπευτικούς ρόλους στην ανασυγκρότηση του κερατοειδούς και στην αποκατάσταση των λειτουργιών του κερατοειδούς μέσω των ανοσορρυθμιστικών, αντιαγγειογενετικών και αντιφλεγμονωδών ιδιοτήτων τους.
Ειδικά τα MSC-εξωσώμια μεσολαβούν στη παρακρινική επικοινωνία των MSC και η τοπική εφαρμογή τους στο βιοϊατρικό πεδίο είναι ελκυστική λόγω της δυνατότητας αποφυγής των προβλημάτων της ογκογένεσης και του ελέγχου της βιολογικής πορείας των κυττάρων.
Πίνακας 1: Η μετάπτωση του φαινοτύπου και μεταβολισμού των στρωματικών κερατοκυττάρων σε ινοβλάστες και μυοϊνοβλάστες μετά από τραυματισμό.
Πίνακας 2: Η επίδραση των παραγόντων E.R.I. (Human Amnion Stromal Extract (εκχύλισμα αμνιακής μεμβράνης), ROCK Inhibitor) και S.E.R.I. (low Serum supplemented (χαμηλής περιεκτικότητας υγρό καλλιέργειας) παράγοντα E.R.I.) στον φαινότυπο και μεταβολισμό των στρωματικών κερατοκυττάρων.
Το βιολογικό μελάνι
Οι ερευνητές στο Πανεπιστήμιο του Newcastle στο Ηνωμένο Βασίλειο κατασκεύασαν έναν βιώσιμο συνθετικό κερατοειδή χρησιμοποιώντας μια διαδικασία τρισδιάστατης βιοεκτύπωσης. Δημιούργησαν πρώτα το υλικό με βιομελάνι με βάση αλγίνες και κολλαγόνο που περιέχει εγκλεισμένα κερατοκύτταρα κερατοειδούς και βλαστικά κύτταρα από ανθρώπινους δότες, παράγοντάς τον μέσα σε 10 λεπτά ή και λιγότερο, από έναν κοινό χαμηλού κόστους τρισδιάστατο εκτυπωτή.
Η μοναδική αυτή γέλη (βιο-μελάνι) είναι ένας συνδυασμός αλγινών και κολλαγόνου, ενώ παράλληλα διατηρεί ζωντανά τα βλαστοκύτταρα, επιτυγχάνοντας έτσι την παραγωγή ενός υλικού που είναι αρκετά σκληρό για να κρατήσει το σχήμα του, αλλά και αρκετά μαλακό για να περάσει μέσα από το ακροφύσιο ενός τρισδιάστατου εκτυπωτή9,10. Ο κερατοειδής εκτυπώνεται σε ομόκεντρους κύκλους με σταδιακή επικάθιση του βιο-υλικού.
Πολλές ερευνητικές ομάδες σε όλο τον κόσμο έχουν προσπαθήσει να δημιουργήσουν το ιδανικό βιο-μελάνι για να καταστήσουν τη διαδικασία αυτή εφικτή. Το συγκεκριμένο βιο-μελάνι που χρησιμοποιήθηκε στο Newcastle, βασίζεται σε προηγούμενο έργο των ερευνητών, στο οποίο κατάφεραν να διατηρήσουν τα κύτταρα ζωντανά για εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου μέσα σε μια παρόμοια υδρογέλη. Έτσι και οδηγήθηκαν στο συγκεκριμένο βιο-μελάνι έτοιμο για χρήση που περιέχει βλαστοκύτταρα, κάτι που επιτρέπει στους χρήστες να αρχίσουν να βιοεκτυπώνουν τους ιστούς χωρίς να χρειάζεται να προβούν σε ξεχωριστή ανάπτυξη των κυττάρων.
Έπειτα από μια πολύ υψηλής ανάλυσης σάρωση του κερατοειδούς ενός εθελοντή, δημιουργήθηκε ένας πρότυπος ψηφιακός κερατοειδής το οποίο αντέγραψε ο τρισδιάστατος βιοεκτυπωτής, μια ισχυρή απόδειξη ότι μπορεί στο μέλλον να είμαστε σε θέση να κατασκευάσουμε εξατομικευμένο κερατοειδή ειδικά για τον κάθε ασθενή. Οι επιστήμονες κατέδειξαν με αυτόν τον τρόπο ότι θα μπορούσαν να κατασκευάσουν έναν συνθετικό κερατοειδή που να ταιριάζει απόλυτα με τις μοναδικές προδιαγραφές του ασθενούς σε μέγεθος και σχήμα, χωρίς τις ατέλειες φυσικά (Εικόνα 3).
Το αποτέλεσμα ήταν η δημιουργία κερατοειδούς που μοιάζει με τη δομή του φυσικού ανθρώπινου στρώματος κερατοειδούς9,10. Βρέθηκε επίσης ότι τα κερατοκύτταρα είχαν υψηλή κυτταρική βιωσιμότητα τόσο την πρώτη ημέρα μετά την εκτύπωση (> 90%) όπως και την έβδομη ημέρα (83%), δίνοντας ακόμη μεγαλύτερη αξιοπιστία στη χρήση αυτής της τεχνολογίας.
Οι τρισδιάστατοι κερατοειδείς χιτώνες υποβάλλονται σε περαιτέρω δοκιμές και θα περάσουν μερικά χρόνια προτού μπορέσουμε να είμαστε στη θέση να τα χρησιμοποιούμε για μεταμοσχεύσεις. Ωστόσο, αυτό που προκύπτει είναι ότι είναι εφικτό να εκτυπώνουμε κερατοειδή χρησιμοποιώντας συντεταγμένες που λαμβάνονται από το άλλο μάτι του ασθενούς και ότι αυτή η προσέγγιση έχει δυνατότητες να καταπολεμήσει την παγκόσμια έλλειψη ιστών.
Το ενδοθήλιο
Το τρίτο και τελευταίο μέρος αλλά και πιο δύσκολο να επιλυθεί είναι το ενδοθήλιο κερατοειδούς. Είναι ίσως το σημαντικότερο ανατομικό μέρος του κερατοειδούς καθότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα με τη βοήθεια αντλιών ιόντων δικαρβονικής ανυδράσης μετακινούν το πλεονάζον νερό από το στρώμα του κερατοειδούς χιτώνα προς τον πρόσθιο θάλαμο διατηρώντας τον κερατοειδή καθαρό. Δυστυχώς τα ενδοθηλιακά κύτταρα πολλαπλασιάζονται από ελάχιστα έως καθόλου καθότι ο μιτωτικός κύκλος τους είναι σε παύση στη φάση G0, οπότε τυχόν τραύματα ή δυστροφίες οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την εκτεταμένη απώλεια ενδοθηλιακών κυττάρων μπορούν γρήγορα να οδηγήσουν λόγω οιδήματος σε θόλωση του κερατοειδούς.
Και ενώ έχουν εξελιχθεί πολλές σύγχρονες χειρουργικές μέθοδοι μεταμόσχευσης ενδοθηλίου με ελάχιστο έως καθόλου στρώμα κερατοειδούς το πρόβλημα ευρέσεως ικανού αριθμού μοσχευμάτων περιορίζει σε χαμηλά νούμερα τον αριθμό μεταμοσχεύσεων που μπορούν να πραγματοποιηθούν. Αν και δεν λείπουν οι πρωτότυπες ιδέες δημιουργίας περισσότερου του ενός μοσχεύματος από ένα κερατοειδή11 τεμαχίζοντάς τον σε τεταρτημόρια με ενθαρρυντικά αρχικά αποτελέσματα αυτός ο αριθμός δεν είναι αρκετός από μια παγκόσμια σκοπιά αναγκών σε ιστούς.
Αυτό που σίγουρα όμως κατανοούμε με τον καιρό είναι ότι η ενεργοποίηση πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, τόσο in vivo όσο και in vitro είναι μια επιτεύξιμη δυνατότητα για το μέλλον.
Πρώτα από όλα in vivo γνωρίζουμε από εργαστηριακές μελέτες ότι το πάχος της Δεσκεμετείου μεμβράνης είναι πολύ σημαντικός παράγοντας επιβιωσιμότητας και λειτουργικότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων, οργανικών και καλλιεργημένων, τα οποία δουλεύουν καλύτερα σε λεπτές μεμβράνες12, ενώ σε παχιές μεμβράνες ή guttate της Δεσκεμετείου άνω των 32μm, τα ενδοθηλιακά κύτταρα απλά δε μπορούν να τα γεφυρώσουν και καταστρέφονται στις παρυφές τους13.
Για τη δε in vitro καλλιέργεια και εν συνεχεία μεταμόσχευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων μέχρι τώρα έχουν εφαρμοστεί τέσσερις κυρίως μέθοδοι:
Α. Μεταμόσχευση καλλιεργημένης στοιβάδας, δίκην μεμβράνης, ενδοθηλιακών κυττάρων.
Αυτή η μέθοδος παρότι επιτυχής σε εργαστηριακό επίπεδο, λόγω ότι χρειάζεται ένα αντίστοιχο χειρουργείο παρόμοιο με τις σύγχρονες τεχνικές DSEK, με τα θετικά και αρνητικά τους, απέτυχε να απλοποιήσει τις θεραπείες μας και γι’ αυτό εγκαταληφθηκε14,15.
Β. Τροποποίηση του γονιδιώματος των ενδοθηλιακών κυττάρων. Σε αυτή τη μέθοδο επιχειρήθηκε η ενσωμάτωση τμήματος γονιδιώματος μέσω πλασμιδίων ή αδενοϊών στο γονιδίωμα των ενδοθηλιακών κυττάρων ώστε να απελευθερωθεί ο μιτωτικός τους κύκλος αλλά δυστυχώς αυτό τα καθιστούσε ανεξέλεγκτα σε προκαρκινικό ή καρκινικό στάδιο οπότε και το ενδιαφέρον για αυτή την τεχνική έχει επίσης ατονίσει16.
Γ. Χρήση του αναστολέα της RHO-κινάσης (ROCK inhibitor).
Ο αναστολέας της GTPase RHO-κινάσης λειτουργεί με το να αυξάνει τη δυνατότητα κινητικότητας και επικοινωνίας των ενδοθηλιακών κυττάρων τόσο προς τα γειτονικά τους κύτταρα αλλά και επικολλήσεως πάνω στη Δεσκεμέτειο μεμβράνη. Αυτό όπως έχουν δείξει οι κατάλληλες μελέτες βοηθάει τα ενδοθηλιακά κύτταρα τόσο στο να μετακινούνται με αμοιβαδοειδείς κινήσεις για να καλύψουν τραύματα του ενδοθηλίου ευκολότερα όσο και στο να παρουσιάζουν ενδείξεις πολλαπλασιασμού τους17.
Δ. Έγχυση καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων στον πρόσθιο θάλαμο.
Η πιο υποσχόμενη για το μέλλον μέθοδος είναι μακράν ο συνδυασμός εγχύσεως καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (ΚΕΚ) στον πρόσθιο θάλαμο του οφθαλμού με την τοπική ενστάλαξη σταγόνων του αναστολέα της RHO-κινάσης (ROCK inhibitor). Αρχικά δοκιμάστηκε η έγχυση ενδοθηλιακών κυττάρων σε μορφή σφαιριδίων όπου ο ασθενής θα κάθεται για λίγες ώρες μετά το χειρουργείο πρηνηδόν ώστε τα σφαιρίδια με τη βαρύτητα να επικαθήσουν επάνω στη Δεσκεμέτειο μεμβράνη και να επικολληθούν με τη βοήθεια των σταγόνων iROCK18,19.
Μια εναλλακτική μέθοδος επικόλλησης των καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (ΚΕΚ) που προτάθηκε από το πανεπιστήμιο του Stanford ήταν η τοποθέτηση μαγνητικών ρινισμάτων μέσα στα KEK ώστε να έλκονται από ένα μαγνητικό φακό επαφής και να παραμένουν στη θέση τους μεγαλύτερο χρονικό διάστημα20.
Το μέλλον στη θεραπεία της ενδοθηλιοπάθειας κερατοειδούς είναι εδώ
Τον Μάρτιο 2018 δημοσιεύτηκε στο πολύ έγκυρο περιοδικό New England Journal of Medicine21, σηματοδοτώντας μια νέα εποχή στις μεταμοσχεύσεις κυττάρων αντί ιστών, η πρώτη μελέτη μιας ομάδας 11 ασθενών με διάγνωση φυσαλιδώδους κερατοπάθειας (μετά από δυστροφία ενδοθηλίου του κερατοειδούς, η οποία και οδήγησε σε θόλωση και απώλεια όρασης) και στους οποίους προεγχειρητικά ήταν αδύνατη η ανίχνευση ενδοθηλιακών κυττάρων.
Υποβλήθηκαν σε θεραπεία έγχυσης μείγματος ανθρώπινων καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (ΚΕΚ) μαζί με τον αναστολέα ROCK στον πρόσθιο θάλαμο. Τα ανθρώπινα ΚΕΚ καλλιεργήθηκαν από κερατοειδή ιστό δότη. Μετά τη διαδικασία, οι ασθενείς τοποθετήθηκαν σε πρινιδόν θέση για 3 ώρες (Εικόνα 4). Ως αποτέλεσμα αυτού ήταν η αποκατάσταση της διαφάνειας του κερατοειδούς, με πυκνότητα ΚΕΚ άνω των 500 κυττάρων ανά τετραγωνικό χιλιοστό μετεγχειρητικά, στον κεντρικό κερατοειδή 24 εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων. Επίσης, το πάχος κερατοειδούς κατέβηκε σε κάτω από 630μm και βελτιώθηκε η οπτική οξύτητα κατά δύο γραμμές.
Σε μία πρόσφατη δημοσίευση της ίδιας επιστημονικής ομάδας, πενταετούς παρακολούθησης των πρώτων 11 ασθενών που υποβλήθηκαν σε έγχυση καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων, η ενδοθηλιακή λειτουργία του κερατοειδούς αποκαταστάθηκε σε 10 από τους 11 οφθαλμούς, ο μέσος αριθμός των ενδοθηλιακών κυττάρων του κεντρικού κερατοειδούς ήταν φυσιολογικός στα 1.257 467 κύτταρα / mm2, ενώ η καλύτερη διορθωμένη οπτική οξύτητα βελτιώθηκε σημαντικά σε 10 οφθαλμούς. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται άμεσα με τη θεραπεία έγχυσης των καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (ΚΕΚ)22.
Εικόνα 3: Η εκτύπωση βιοσυνθετικού στρώματος κερατοειδούς με βιο-μελάνι.
Εικόνα 4: Σφαιρίδια ανθρώπινων καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (ΚΕΚ) στην εσωτερική επιφάνεια του κερατοειδούς του λήπτη.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3ο: ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Τρισδιάστατη βιολογική εκτύπωση, μηχανική ιστών, κερατοκύτταρα κερατοειδούς, βιολογικό μελάνι κολλαγόνου
Όλοι οι παραπάνω είναι καινούργιοι όροι που εισάγονται σταδιακά στο λεξιλόγιο των οφθαλμιάτρων παγκοσμίως και φέρνουν κατακλυσμιαίες αλλαγές στις θεραπείες μας. Η τεχνολογία έχει έρθει για άλλη μια φορά να σώσει την κατάσταση για την ανθρωπότητα- αυτή τη φορά με την ελπίδα να προσφέρει βιοσυνθετικό κερατοειδή για τα σχεδόν 15 εκατομμύρια ασθενών παγκοσμίως που έχουν χάσει την όρασή τους -λόγω διάφορων παθολογικών καταστάσεων- που σχετίζονται με κερατοειδικές ουλές23 και για διάφορους λόγους δεν έχουν πρόσβαση στις συγχρόνες θεραπείες.
Η βιομηχανική των κερατικών στρωματικών κερατοκυττάρων προσφέρει μια συναρπαστική νέα προοπτική βελτίωσης των αποτελεσμάτων μας στις μεταμοσχεύσεις στοχευμένου ιστού προς μεταμόσχευση. Τα καλλιεργημένα κερατοκύτταρα μπορούν να αποτελέσουν αξιόπιστη εναλλακτική για πιθανή θεραπεία σε κυτταρικό επίπεδο για τη λέπτυνση και θόλωση του κερατοειδούς.
Με τη συνεχιζόμενη έρευνα καθιερώνεται η ασφάλεια, σκοπιμότητα και θεραπευτική αποτελεσματικότητα της ενδοστρωματικής έγχυσης καλλιεργημένων κερατοκυττάρων. Με την έγχυση κερατοκυττάρων στο στρώμα του κερατοειδούς διατηρείται η διαύγεια του κερατοειδούς, ενώ τα κερατοκύτταρα αποθέτουν και ίνες κολλαγόνου και πρωτεογλυκάνες στο στρώμα/δέκτη ενώ η μετάπτωση σε ινοβλάστες είναι αμελητέα17.
Η θεραπευτική ικανότητα της ενδοστρωματικής έγχυσης κερατοκυττάρων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας το μοντέλο αρχόμενης θόλωσης κερατοειδούς σε τρωκτικά όπου η διαύγεια του κερατοειδούς και το πάχος του στρώματος αποκαταστάθηκαν σε σύγκριση με ιστούς χωρίς θεραπεία19.
Από την άλλη η ένεση ανθρώπινων καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (ΚΕΚ) συμπληρωμένων με αναστολέα ROCK σε συνδυασμό με ένα τρισδιάστατα βιοεκτυπωμένο συνθετικό στρώμα κερατοειδούς -ακολουθώντας το καλούπι του κερατοειδούς του υγιούς οφθαλμού- βάζει τις βάσεις για τη δημιουργία του πρώτου 100% εξατομικευμένου βιοσυνθετικού κερατοειδούς χιτώνα καθιστώντας πιθανόν παρωχημένη τη χρήση μοσχευμάτων από νεκρό δότη στο μέλλον και λύνοντας το πρόβλημα ευρέσεως ιστού.
Οι τρισδιάστατοι βιοσυνθετικοί κερατοειδείς χιτώνες θα πρέπει να υποβληθούν σε περαιτέρω μελέτες και θα περάσουν ορισμένα χρόνια πριν αντιμετωπιστούν τα κύρια προβλήματα αυτών (στατιστικά σημαντική απώλεια έως 70% του αριθμού των κερατοκυττάρων και έλλειψη βίο-μηχανικής σταθερότητας του στρωματικού συνδετικού ιστού) προτού μπορέσουμε να είμαστε στη θέση να τους χρησιμοποιούμε για μεταμοσχεύσεις στους ασθενείς μας.
Ως εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας να συνεχίσουν να πείθονται οι άνθρωποι να συναινούν ως δωρητές οργάνων καθότι για πολύ καιρό ακόμα η μεταμόσχευση κερατοειδούς από νεκρό δότη θα συνεχίσει να προσφέρει στους ασθενείς το αγαθό της όρασης.
Επίλογος
Τα βασικά χαρακτηριστικά της κυτταρικής βιομηχανικής που θα τη καταστήσουν ακόμη σημαντικότερη στο μέλλον είναι:
- Εφαρμογή της σε μεγαλύτερες κλίμακες παραγωγής.
- Αυξημένη απόδοση/Ευκολία χειρουργικής τεχνικής με απλή έγχυση κυττάρων σε στρώμα ή ενδοθήλιο.
- Επιβολή σε όλα τα κυτταρικά προϊόντα, υψηλών κανόνων ορθών πρακτικών κατασκευής (GMP), με αυστηρή αδειοδότηση και επανελέγχους από τις αρμόδιες αρχές, που ναι μεν θα αυξήσουν το κόστος και θα επιβραδύνουν την εφαρμογή στη κλινική πρακτική, θα εγγυηθούν όμως υψηλής ποιότητας και ασφάλειας υπηρεσίες για τους ασθενείς μας.
Βιβλιογραφία
- Tan DT, et al. Corneal Transplantation. Lancet 2012 May 5:379 (9827) 1749-61.
- EBAA: Domestic trends in PK and EK 2005-2014.
- SM Daya, et al. Outcomes and DNA Analysis of Ex Vivo Expanded Stem Cell Allograft for Ocular Surface Reconstruction. Ophthalmology 2005; 112:470–477.
- Shanbhag S. et al. Simple limbal epithelial transplantation (SLET): Review of indications, surgical technique, mechanism, outcomes, limitations, and impact. Indian J Ophthalmol. 2019 Aug; 67(8): 1265-1277.
- Fuest M, Hin-Fai Yam G, Swee-Lim Peh G, Mehta JS. Advances in corneal cell therapy. Regen. Med. (2016) 11(6), 601–615.
- Hin-Fai Yam G, Yusoff N, Kadaba A, et al. ZB, Ex Vivo Propagation of Human Corneal Stromal “Activated Keratocytes” for Tissue Engineering. Cell Transplantation, Vol. 24, pp. 1845–1861, 2015.
- Hin-Fai Yam G, Fuest M, Yusoff N, et al. Safety and Feasibility of Intrastromal Injection of Cultivated Human Corneal Stromal Keratocytes as Cell-Based Therapy for Corneal Opacities. IOVS, July 2018, Vol. 59, No. 8 3340.
- Mansoor H, Ong HS, Riau AK, et al. Current Trends and Future Perspective of Mesenchymal Stem Cells and Exosomes in Corneal Diseases. Int J Mol Sci. 2019 Jun; 20(12): 2853.
- Isaacson A, Swioklo S, Connon CJ. 3D bioprinting of a corneal stroma equivalent. Experimental Eye Research. 2018 Aug;173:188-193.
- Newcastle University. First 3D printed human corneas. Press Office. May30,2018.www.ncl.ac.uk/press/articles/latest/2018/05/ first3dprintingofcorneas. Accessed May 31, 2018.
- Müller, TM, et al. Case Report of Quarter–Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty for Fuchs Endothelial Dystrophy. Cornea. 36(1): 104-107, January 2017.
- Tsaousis, Konstantinos, et al. In Vitro Study of the Deturgescence Ability of Cultivated Human Corneal Endothelial Cells. Cornea. 35(5): 669-672, May 2016.
- Kocaba Viridianna. Personal communication. Harvard University 2016.
- Koizumi N, et al. Cultivated corneal endothelial transplantation in a primate: possible future clinical application in corneal endothelial regenerative medicine. Cornea. 2008; 27(suppl 1): S48–S55.
- Koizumi N, et al. Development of new therapeutic modalities for corneal endothelial disease focused on the proliferation of corneal endothelial cells using animal models. Experimental Eye Research 95 (2012) 60-67.
- Yokoo S, et al. Human Corneal Endothelial Cell Precursors Isolated by Sphere-Forming Assay. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46: 1626–1631.
- Okumura N, et al. The New Therapeutic Concept of Using a Rho Kinase Inhibitor for the Treatment of Corneal Endothelial Dysfunction. Cornea 2011; 30 (Suppl. 1): S54–S59.
- Yokoo S, et al. Human Corneal Endothelial Cell Precursors Isolated by Sphere-Forming Assay. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46: 1626–1631.
- Mimura T, et al. Sphere Therapy for Corneal Endothelium Deficiency in a Rabbit Model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46:3128–3135.
- Goldberg J. AAO Meeting. Chicago 2016.
- Kinoshita S, et al. Injection of Cultured Cells with a ROCK Inhibitor for Bullous Keratopathy. N Engl J Med. 2018 Mar 15; 378(11): 995- 1003.
- Numa K, et al. Five-Year Follow-up of First 11 Patients Undergoing Injection of Cultured Corneal Endothelial Cells for Corneal Endothelial Failure. Ophthalmology, 2021 Apr;128(4):504-514.
- Witcher J, et al. Corneal blindness: A global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 2001; 79(3): 214-21.
